Nguyễn Thuật vừa làm việc quan vừa tự học. Khoa thi Bính Tý (1876), ông thi Hương ở Nam Định đỗ thủ khoa. Năm 1877, ông được bổ làm tri phủ Từ Sơn. Vì có người cùng thời làm quan cũng tên là Nguyễn Thuật, ông làm sớ xin nhà vua cho đệm chữ Thiện, nhà vua ưng thuận, các anh em ông cũng đệm chữ Thiện. Tháng 6 năm Kỷ Mão (8/1 879), Nguyễn Thiện Thuật được thăng Tán tương quân thứ, hai năm sau ông được thăng Sơn phòng chánh sứ, kiêm Tán tương quân thứ Sơn Tây. Ông cùng Thống đốc Hoàng Tá Viêm thu phục mười sáu châu từ Bắc Giang đến Sơn La, bình định Ba Bể, lập nhiều công to. 

   Ngày 10 tháng 7 năm Quý Mùi (9/8/1883) đại uý Briolval hạ thành Hải Dương. Triều đình cử ông về làm Tổng đốc Hải – Yên (Hải Dương-Quảng Yên, bao gồm cả Hải Dương, Hải Phòng, Quảng Ninh ngày nay), đồng thời làm Phó nguyên suý Đạo binh Đông bắc dưới quyền Thống đốc Hoàng Tá Viêm. Ông thành lập đạo quân gồm người Nam và người Khách ở huyện Đông Triều định thu phục Ninh Hải (Hải Phòng), nhưng việc không thành. Ngày 20/8/1883, Triều đình ký với Pháp Hiệp ước Harmand ra lệnh cho các quân thứ Bắc Kỳ: “Phải lập tức triệt binh dũng lui để tỏ điều tin đối với nước Đại Pháp”, đòi “quan lại đang đánh Pháp ở Bắc Kỳ về Kinh đợi chỉ”.

   Nguyễn Thiện Thuật kháng chỉ bỏ chức Tổng đốc Hải – Yên về Đông Triều mộ quân đánh Pháp. Hưởng ứng lời kêu gọi của Nguyễn Thiện Thuật, nhiều bậc chí sĩ, quan lại, tổng lý, nông dân, dân nghèo, binh sĩ yêu nước đã nhiệt liệt tham gia và nổi dậy ở nhiều nơi. Ông thành lập đội quân lấy Đông Triều làm căn cứ. Hoạt động của nghĩa quân Nguyễn Thiện Thuật làm cho quân Pháp chịu nhiều tổn thất nặng nề.

   Nguyễn Thiện Thuật cũng quan hệ chặt chẽ với Đinh Gia Quế thủ lĩnh cuộc khởi nghĩa Bãi Sậy, ông về căn cứ Thọ Bình dự lễ tế Cờ khởi nghĩa của Đổng Quân vụ Đinh Gia Quế.

   Chiều ngày 12/11/1883, Nguyễn Thiện Thuật giao cho Lãnh Giang ở lại giữ Đông Triều còn ông cùng Nguyễn Thiện Kế, Đề Vinh dẫn quân về đánh thành Hải Dương. Tám giờ tối, nghĩa quân bí mật bao vây, sắp tới giờ nổ súng thì cánh quân bên ngoài do Hai Kế chỉ huy chạm trán với toán quân Pháp đi tuần về nên buộc lòng phải nổ súng.

   Mặc dù mất yếu tố bất ngờ, Nguyễn Thiện Thuật vẫn quyết tâm đánh thành. Trước sức tấn công mãnh liệt của nghĩa quân, thành Hải Dương lâm vào thế nguy ngập, trời gần sáng, thành sắp bị hạ thì ông Thuật hạ lệnh ngừng công phá thành, bắn thưa thớt rồi lui quân. Ông Thuật vừa rút khỏi thành phố thì quân Pháp ở Bắc Ninh tới tiếp viện, nhưng quân ông Thuật đi đã xa.

   Sau trận hạ thành Hải Dương không thành, Nguyễn Thiện Thuật phối hợp với các lực lượng nghĩa quân khác và quân triều đình do phe chủ chiến chỉ huy hoạt động ở vùng sông Thái Bình, sông Kinh Thày, Phả Lại, Lục Đầu Giang, các tỉnh Bắc Ninh, Hưng Hoá, Phủ Lạng Thương, Tuyên Quang.

   Ngày 26/10/1884 , Nguyễn Thiện Thuật cùng Lã Xuân Oai Tuần phủ Cao Bằng – Lạng Sơn, Đề đốc Tạ Hiện, Ngự sử Phạm Huy Quang cùng mười tám thân hào tỉnh Hải Dương phối hợp với quân Thanh do các tướng Đường Cảnh Tùng, Hoàng Quế Lan chỉ huy phục kích quân Pháp ở cầu Quan Âm (Bắc Lệ, Lạng Sơn) giết chết 21 tên Pháp.

   Ngày 28/3/1885, nghĩa quân Nguyễn Thiện Thuật tham gia chặn đánh quân Pháp khi chúng đánh thành Lạng Sơn. Quân Pháp đại bại bị chết trên 100 tên, tướng Negrier bị thương nặng ở ngực tại Kỳ Lừa, quân Pháp phải rút chạy về Chũ.

   Cuối tháng 3/1885 Pháp và nhà Thanh ký “Hiệp ước Hòa bình” buộc Lưu Vĩnh Phúc đem quân về nước, Nguyễn Thiện Thuật và các cánh quân khác yếu thế phải rút vào rừng. Bị quân Pháp truy lùng gắt gao, ông phải tạm lánh sang Long Châu (Trung Quốc).

   Tháng 7 năm 1885, Nguyễn Thiện Thuật nhận được tin vua Hàm Nghi xuất bôn ra Quảng Trị hạ chiếu Cần vương, liền về căn cứ Tiên Động (thuộc thượng huyện Cẩm Khê, nay thuộc huyện Lâm Thao, tỉnh Phú Thọ) gặp Lễ bộ thượng thư sung Hiệp thống Bắc Kỳ quân vụ đại thần Nguyễn Quang Bích nhận chiếu Cần vương. Nguyễn Quang Bích tâu với vua Hàm Nghi phong ông là Bắc Kỳ Hiệp thống quân vụ đại thần gia chấn trung tướng quân trực tiếp lãnh đạo cuộc khởi nghĩa Bãi Sậy. 

   Tháng 9/1885, Nguyễn Thiện Thuật tổ chức lễ Tế cờ khởi nghĩa và hội nghị tướng sĩ ở Văn chỉ xã Bình Dân, tổng Bình Dân, huyện Đông Yên, phủ Khoái Châu. Sau lễ tế cờ Nguyễn Thiện Thuật đã cho quân vượt sông Hồng đánh sang các huyện Thanh Trì, Thường Tín, Phú Xuyên, Ứng Hoà.

   Đêm 28 rạng ngày 29 tháng 9/1885 , quân Bãi Sậy tấn công thành Hải Dương, bọn chỉ huy Pháp ở Hải Dương phải đưa quân ra ngoài thành chặn đường nghĩa quân.

   Nguyễn Thiện Thuật lệnh cho các tướng bí mật đồng loạt tấn công vào các đồn bốt địch, chặn đường hành quân của chúng, mặt khác tăng cường phòng thủ căn cứ Bãi Sậy nhiều vòng. Nguyễn Thiện Thuật còn phái các đội vũ trang tuyên truyền đi dán các bản Tuyên cáo ở khắp các thôn xóm, kêu gọi lính An Nam đào ngũ, bắn vào đầu bọn chỉ huy Pháp, bọn quan chức Việt Nam theo Pháp lập công trở về với hàng ngũ kháng chiến.    Dưới sự lãnh đạo của Nguyễn Thiện Thuật và bộ tham mưu nghĩa quân vẫn đánh thắng nhiều trận lẫy lừng như các trận do Đốc Tít, Lưu Kỳ, Hai Kế, Lãnh Giang, Đội Văn, Đốc Cọp, Đốc Sung chỉ huy.

   Tháng 10/1890, Nguyễn Thiện Thuật thấy tình thế nhiều khó khăn, ông trao binh quyền cho em là Nguyễn Thiện Kế rồi sang Trung Quốc mưu tính một cuộc vận động mới. Song tình thế đã khác trước, việc không thành, ông đành ở lại nhà tướng Cờ Đen Lưu Vĩnh Phúc.

   Nguyễn Thiện Thuật mất ngày 26/5/1926 (15 tháng 4 âm lịch). Mộ táng tại núi Vạn Hoa Cương, thành phố Nam Ninh, tỉnh Quảng Tây, Trung Quốc.

   Được sự ủy nhiệm của ủy ban nhân dân tỉnh Hưng Yên, Sở Văn hóa thông tin tỉnh Hưng Yên cùng dòng họ ngày 30/1/2005 đã đưa hài cốt của ông về táng ở khu tưởng niệm Bắc Kỳ Hiệp thống quân vụ đại thần Nguyễn Thiện Thuật tại quê nhà xã Xuân Dục, huyện Mỹ Hào, tỉnh Hưng Yên.