Nguyễn Hữu Huân sinh năm 1841, người làng Tịnh Hà, huyện Kiến Hưng, tỉnh Định Tường (nay thuộc tỉnh Kiên Giang). Ông đỗ thủ khoa khoa thi Hương khi chưa đầy 20 tuổi, nên gọi là Thủ khoa Huân. Ông được cử làm giáo thụ huyện Kiến Hưng.

Ngày 17/2/1859, chiến thuyền của liên quân Pháp – Tây Ban Nha mở cuộc tấn công qui mô lớn vào tỉnh thành Sài Gòn, tỉnh thành Gia Định. Gia Định thất thủ, Nguyễn Hữu Huân đứng hẳn về phe những người chủ chiến.

Năm 1861, Nguyễn Hữu Huân khởi nghĩa chống Pháp, ông được bổ chức Phó quản đạo. Ông chia quân đi hoạt động khắp tỉnh Định Tường và đến các miền tỉnh Hà Tiên. Ông liên kết với quân của Âu Dương Lâu và của Võ Duy Dương. Quân các ông ít súng bắn nhanh, chủ yếu là giáo mác. Vì vậy ông đã quyên góp được nhiều tiền, giao thiệp với các chủ tàu buôn Hải Nam đế mua khí giới của Trung Hoa.

Khi quân Pháp tập trung quân càn quét, ông cho nghĩa quân phân tán, rút lui, lợi dụng địa hình, địa vật đánh theo lối du kích trên địa bàn rộng lớn từ Tân An đến Mỹ Tho. Sau hết lương thực, ông xuống Hậu Giang chờ khí giới chuyển sang. Khi thế cùng, lực kiệt, ông phải giải tán bớt nghĩa quân về ẩn náu ở Chợ Gạo, Định Tường mưu cuộc khởi nghĩa khác.

Năm 1863, khi quân Pháp bao vây, ông vượt vòng vây đến Châu Đốc, nhưng ông bị bọn quan lại của triều đình Huế bắt giao cho quân Pháp. Giặc Pháp hết tra tấn lại dụ dỗ ông ra làm quan cho chúng nhưng ông cự tuyệt, bị thực dân Pháp bắt đi đầy. Sau đó không khai thác được gì, chúng trả tự do cho ông, chưa kịp nghỉ ngơi, dưỡng sức, sau những năm bị đày ải ở chốn lao tù, ông lại hô hào nhân dân chuẩn bị khởi nghĩa. Nhân dân rất tin tướng, quý mến ông, gia nhập nghĩa quân do ông chỉ huy rất đông. Ông lại trở về Châu Đốc bổ sung lực lượng nghĩa quân, trang bị vũ khí đánh giặc.
Năm 1864, Achar Xva (Axoa) khởi nghĩa ở Ba Phnom (Cămpuchia), rồi chuyển sang Châu Đốc, Hà Tiên, dựa vào Việt Nam chiêu mộ người Việt gốc Khmer để tổ chức lực lượng nghĩa quân về đánh chiếm Campot. Achar Sva liên lạc được với lực lượng của nghĩa quân thủ khoa Huân, đánh thắng Pháp nhiều trận lớn.

Năm 1864, ông lại bị giặc Pháp bắt đày đi Côn Đảo. Sau đó đày sang đảo Reunion.

Năm 1874, triều đình ký hòa ước nhường lục tỉnh cho Pháp, chúng mới cho ông trở về. Quản thúc ở nhà Tổng đốc Đỗ Hữu Phong ở Chợ Lớn là tay chân đắc lực của Pháp và là nơi quen biết ông. Phong mở một tiệc lớn có đại diện bọn cầm quyền Pháp, Nam dự. Sau bữa tiệc nhiều người muốn xin thơ của ông làm kỷ niệm. Ông tức cảnh làm bài thơ bát cú, nói lên nỗi lòng tâm sự của mình và phê phán một số người ra làm quan cho giặc đàn áp dân.

Sau đó ông được trả tự do. Ngay khi được tự do, Nguyễn Hữu Huân lại cùng các văn thân Nam Kỳ như Âu Dương Lâu chiêu mộ quân đánh Pháp. Ông đặt đại bản doanh ở Long Trì. Lực lượng nghĩa quân đông tới 3000 người, đánh Pháp trên toàn tỉnh Định Tường nơi hoạt động chủ yếu từ Tân An đến Mỹ Tho. Cuộc khởi nghĩa lần thứ hai của Nguyễn Hữu Huân diễn ra trên địa bàn chủ yếu là Định Tường. Nhưng nhân dân Bến Tre đã nô nức hưởng ứng bằng cách tham gia nghĩa quân, ủng hộ lương thực, tiền bạc, để mua vũ khí.

Nguyễn Hữu Huân còn thường xuyên làm công tác vận động binh lính mã tà bỏ hàng ngũ địch về với nhân dân. Nhiều lính mã tà đem vũ khí về với nghĩa quân hoặc đào ngũ đi nơi khác làm ăn.

Đầu tháng 5 năm Ất Hợi (5/1875) quân Pháp huy động lực lượng lớn quân đội, cảnh sát chia làm nhiều ngả vây đánh nghĩa quân ở Long Trì.

Nghĩa quân dựa vào địa thế hiểm trở và đặc biệt được nhân dân ủng hộ về mọi mặt đã kiên cường đánh trả quân Pháp, giữ vững căn cứ trong nửa tháng. Quân Pháp bị thương vong nặng nề. Với dã tâm đè bẹp nghĩa quân, bắt hoặc giết cho được thủ lĩnh nghĩa quân Nguyễn Hữu Huân, giặc Pháp điều động thêm quân lính, súng đại bác đánh mạnh vào căn cứ Long Trì. Nghĩa quân tan vỡ, Nguyễn Hữu Huân phải rút quân về Chợ Gạo, sau đó ông trở ra Bình Thuận phát động cuộc khởi nghĩa lần thứ ba.

Giặc Pháp đánh mãi không được lại dùng thủ đoạn mua chuộc những kẻ thoái hóa trong hàng ngũ, nghĩa quân làm phản chỉ điểm cho giặc bắt ông. Chúng kết án ông tử hình.

Ngày 15 tháng 5 năm Ất Hợi (18/6/1875) ông bị giặc Pháp bắt đưa ra chợ Thôn Trong (tức chợ Phú Kiết) hành hình. Ông ung dung đọc bài thơ Hãn mã bày tỏ khí phách hiên ngang của mình.

HÃN MÃ

Hãn Mã gian quan vị quốc cừu,
Chủ nhân binh bại bù thân hưu
Anh hùng mạc bả dinh dự luận,
Vũ trụ trường khan tiết nghĩa lưu
Vô bố dĩ kinh hồ lỗ phách
Bắt hàng can đoạn tướng quân đầu
Dương niên Tho Thủy li ba huyết
Lang đảo thu phong khởi mộ sầu

Dịch thơ:

Ruổi rong vó ngựa báo thù chung
Binh bại cho nên mạng mới cùng.
Tiết nghĩa vẫn lưu cùng vũ trụ,
Hơn thua xá kể với anh hùng
Không hàng đầu tưởng đánh rơi xuống
Quyết thác không hàng rạng núi sông
Tho Thủy ngày rày pha máu đỏ
Đảo Rồng hưu hắt ngọn thu phong.

(Phan Bội Châu dịch)

Có sách chép bài thơ Tuyệt mệnh của ông như sau:

Hai liên thiên hạ thống hay không?
Một gánh cưng thường, há phải gông!
Oằn oại hai vai quân tử trúc
Long đong một cổ trượng phu tòng;
Sống về đất Bắc danh còn rạng
Thác ở Thành Nam tiếng bỏ không.
Thắng bại danh du ai khiến chịu
“Phản thần” đẻo quả đứa còn ông.

Ngâm xong bài thơ Tuyệt mệnh ông cắn lưỡi tự tử không chịu để giặc Pháp chém đầu.