Nguyễn Ngọc Thăng sinh năm 1798, con cụ Nguyễn Công và cụ Trần Thị Kiêm, quê tại ấp Giồng Keo, làng Mỹ Thạnh, huyện Giồng Trôm, tỉnh Bến Tre. Ông hiếu học lại thông minh nên trong khi học chữ nho vẫn đến các lò võ trong vùng để học võ.

Ông đăng lính vào thời vua Thiệu Trị. Nhờ biết võ nghệ, huấn luyện tốt quân sĩ, củng cố đồn lũy vững chắc, ông được thăng Cai cơ. Đầu năm Tự Đức nguyên niên (1848), ông được thăng Lãnh binh.

Ngày 17 tháng 2 năm 1859, quân Pháp đánh chiếm các pháo đài bảo vệ thành Gia Định từ xa. Lãnh binh Nguyễn Ngọc Thăng không chờ lệnh mà đem quân cấp tốc đi ứng cứu. Nhưng trước sức mạnh của đại bác, tàu chiến, súng bắn nhanh quân Pháp đã chiếm được hết các pháo đài và cửa biển Cần Giờ. Quân giặc theo đường sông tiến sát tỉnh thành rồi đổ bộ đánh phá. Đến 10 giờ sáng ngày 17/2/1859 thành Gia Định vỡ.

Lãnh binh Nguyễn Ngọc Thăng được lệnh đóng giữ đồn Cây Mai. Ngay lập tức ông đã điều động quân lính và nhân dân xây dựng hệ thống phòng thủ, đắp lũy thêm cao, đào hào thêm sâu, bố trí lực lượng phòng thủ ở những vị trí xung yếu. Đội quân của Nguyễn Ngọc Thăng đã đẩy lùi nhiều đợt tấn công của quân Pháp. Nhưng do quân Pháp có ưu thế về quân binh, vũ khí, nên sau một thời gian cầm cự, lãnh binh Nguyễn Ngọc Thăng phải bỏ đồn rút về Gò Công, khi đó vẫn thuộc phủ Tân An, tỉnh Gia Định.

Khi chủ tướng Trương Định hy sinh trong mặt trận tập kích bất ngờ do tên phản bội Huỳnh Văn Tấn (Đội Tấn) dẫn quân Pháp vào bao vây, đánh úp, Nguyễn Ngọc Thăng tiếp tục lãnh đạo nghĩa quân chống Pháp ở hữu ngạn sông Soài Rạp cho đến cửa Tiểu, thuộc Gò Công. Trong nhiều trận đánh ông đã phối hợp với nghĩa quân do Trương Quyền, con của Trương Định chỉ huy hoạt động ở vùng Tây Ninh và nghĩa quân do Thiên hộ Dương chỉ huy chiến đấu ở vùng Đồng Tháp Mười.

Ngày 27/6/1866, trong một trận giao chiến với quân Pháp, Nguyễn Ngọc Thăng trúng đạn hy sinh. Nghĩa quân lợi dụng đêm tối, dùng ghe đưa về quàn ở tỉnh Mỹ Lồng, bên cạnh mé sông để nhân dân trong vùng đến điếu phúng. Mộ ông đặt tại một con giồng nhỏ ở Mỹ Lồng thuộc làng Mỹ Thạnh. Sau khi ông mất, vua Tự Đức phong sắc, áo, mão và một thanh gươm. Những di vật này đặt tại ngôi miếu thờ ông ở ấp Giồng Keo bị hư hỏng trong chiến tranh và thất lạc.

Ông còn được thờ ở đình làng Nhơn Hòa, nay thuộc phường Cầu Ông Lãnh (quận I, thành phố Hồ Chí Minh) và tại đình làng Mỹ Thạnh, huyện Giồng Trôm. Hàng năm vào dịp lễ Cầu Yên, tại hai nơi này đều tế lễ long trọng để ghi nhớ công ơn người anh hùng chống Pháp.