Ngày 25/2/1861, ông tham gia chống quân Pháp ở Đại đồn Kỳ Hòa dưới sự chỉ huy của Nguyễn Tri Phương. Đồn Kỳ Hòa vỡ, ông cũng thu thập tàn quân ở Kỳ Hòa, tuyển thêm quân mới đánh quân Pháp hàng chục trận ở trên bộ và dưới sông tại ba tỉnh miền Đông.

Ngày 10/12/1861, ông chỉ huy quân đốt cháy tàu Hy Vọng do tên trung úy Bacfe chỉ huy 45 tên lính trên sông Vàm Cỏ Đông thuộc thôn Nhật Tảo. Nghĩa quân chỉ có 54 người đã tiêu diệt toàn bộ quân lính trên tàu quân tới cứu viện. Nghĩa quân hy sinh 4 chiến sỹ. Đây là trận đầu tiên quân ta nhấn chìm được tầu đồng của phương Tây giữa ban ngày khiến cho giặc Pháp phải kinh hoàng.

Sau trận này tiếng tăm của Nguyễn Văn Lịch nổi lên như một lãnh tụ nghĩa quân kiệt xuất bên cạnh tướng quân Trương Định. Triều đình Huế phong sung chức Quản cơ. Ông ra kinh đô Huế nhận chức rồi vào Hà Tiên làm Thành thủ úy.

Năm 1862, Nguyễn Văn Lịch tấn công tiểu hạm do đại úy Gougeard chỉ huy tại Vũng Gù. Ông còn tấn công đồn Thủ Thừa và đồn Tân Uyên nhiều trận dữ dội.

Ngày 16/2/1862, Nguyễn Văn Lịch lại đánh tầu tại bến Lức trên sông Rạch Tra. Trong trận này nghĩa quân táo bạo đánh giặc với phương thức hết sức thủ công, là nghĩa quân dùng sợi dây đôi buộc vào tầu rồi đứng trên bờ đồng thanh hò la kéo cho tàu chạy mắc cạn để phóng hỏa đốt tầu. Quân Pháp phải dùng súng bắn đá, nạp đạn bằng sắt để bắn trả.

Triều đình Huế dấn sâu vào con đường bán nước, thăng cho Nguyễn Văn Lịch chức Lãnh binh để điều ông ra miền Trung. Nguyễn Văn Lịch chống lệnh, trả chức tước của triều đình, đổi tên là Nguyễn Trung Trực, đưa nghĩa quân về cứ điểm Hòn Chông lập đồn trại, huấn luyện tân binh, xây dựng lực lượng. Ông còn có tên nữa là Quản Chôm (Chôm là Châu Trực, Trung Trực). Tại căn cứ Hòn Chông, ông được đồng bào ở Tà Niên, Đông Yên, Vĩnh Hòa, nhiệt liệt gia nhập nghĩa quân, ủng hộ quân lương, giúp nghĩa quân xây dựng đồn trại.

Khoảng ngày 10/6/1868, Nguyễn Trung Trực từ Hòn Chông theo đường biển vào sông Cái Bè rồi vào rạch Trà Niên. Tại đây ông chiêu tập được 100 nghĩa quân một cách nhanh chóng. Nghĩa quân chỉ được trang bị giáo, mác là chính để đánh đồn Kiên Giang (nay là thị xã Rạch Giá). Rạng sáng ngày 16/6/1868, nghĩa quân áp sát một cách bí mật chiếm được đồn.

Cay cú trước thất bại nhục nhã đó, ngày 18/6/1868, tên trung tá hải quân An Sa (Ansart) từ Vĩnh Long đem theo lực lượng lớn quân Pháp, chia làm ba cánh quân theo hai đường thủy bộ tiến đánh tỉnh lỵ Rạch Giá. Ngay trưa 18/6/1868, Nguyễn Trung Trực đã phán đoán quân Pháp sẽ tiến công, nên đã có kế hoạch tác chiến từ xa. Trước sức tấn công mãnh liệt của giặc có ưu thế về quân số và vũ khí, Nguyễn Trung Trực lui về đồn Kiên Giang. Trận này nghĩa quân làm chủ tỉnh lỵ được sáu ngày.

Nghĩa quân phải xuống thuyền trở lại Hòn Chông. Nguyễn Trung Trực phán đoán, quân Pháp có hạm đội ca nô, phần lớn là lính hải quân chúng sẽ bao vây chặt Hòn Chông mà tiêu diệt. Vì vậy nghĩa quân lấy 40 chiến thuyền do ông chuẩn bị từ trước vượt biển chạy ra đảo Phú Quốc. Khi tên Đômănggơ chỉ huy một cánh bộ binh từ Châu Đốc tiến qua Hà Tiên, men theo ven biển xuống Hòn Chông, thì loàn bộ nghĩa quân đã rút lui an toàn. 

Nguyễn Trung Trực đổ bộ vào An Thái, cực nam đảo Phú Quốc, và được chánh tổng Nguyễn Văn Điền và Xã Ngợi rất ủng hộ. Sau đó ông dẫn quân lên đóng ở ven rừng Hàm Ninh, xây dựng trận địa phòng thủ.

Giặc Pháp đưa tên phản bội Huỳnh Văn Tấn, kẻ đã bắt Trương Định giao cho Pháp, nay được giặc cho làm lãnh binh tới bắt Nguyễn Trung Trực. Tên này đưa 125 lính tập trung dân làng, buộc mọi người phải chỉ dẫn chỗ ở của Nguyễn Trung Trực, nhưng không ai chịu nói. Tên phản bội sai lính treo ngược mọi người lên tra tấn dã man nhưng không ai khai một lời. Tin này truyền đến tai Nguyễn Trung Trực, ông không muốn vì ông mà nhân dân bị giặc tàn sát, bèn sai đổ quân lương xuống sông, giải tán nghĩa quân còn lại, sai người trói ông lại, giả là bắt được, dẫn về Đông Dương. Đến nơi ông đứng trên cồn bên Hữu Ngạn gọi Tấn đem thuyền ra đón. Giặc bắt được Nguyễn Trung Trực vào ngày 19/9/1868.

Bọn xâm lược Pháp và lũ tay sai ra sức dụ dỗ ông theo chúng, vẫn không lay chuyển được tấm lòng trung với nước của ông. Chúng đưa ông về Rạch Giá, kết án xử tử hình ông.

Ngày 27/10/1868, đưa ông ra xử tử hình công khai ở Rạch Giá. Ông bình tĩnh, đòi giặc mở trói, mặc lễ phục áo thụng, khăn đen đường bệ. Ông còn đòi cho nhân dân trong tỉnh đến chứng kiến để có dịp vĩnh biệt nhân dân.

Đao phủ hôm ấy không phải là người Việt Nam, và không ai muốn tự tay giết một vị anh hùng. Trước khi giặc hành quyết, ông dõng dạc tuyên bố: “Bao giờ người Tây nhổ hết cỏ nước Nam, thì mới hết người Nam đánh Tây”.

Khi đầu ông rơi xuống đất trong pháp trường cũng có người tự vẫn để tỏ lòng thương tiếc ông. Nhân dân xin thi thể ông về mai táng trọng thể. Ở Long Kiên, Rạch Giá vẫn còn mộ và đền thờ ông.

Tin Nguyễn Trung Trực hy sinh truyền đến triều đình Huế, vua Tự Đức, một người chủ trương chủ hòa cũng phải làm thơ nhiệt liệt ca ngợi ông.

Đền thờ Nguyễn Trung Trực ở Rạch Giá hàng ngày có hàng trăm người đến thắp hương tưởng niệm ông.